市販エアーを用いた微細藻類の培養特性

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3792 (2023) この記事を引用

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エアクッション (AC) 包装は世界中で広く使用されています。 AC は空気を充填した二重プラスチック包装ソリューションで、輸送中に輸送箱内の貴重品を囲み、保護するためによく見られます。 ここでは、微細藻類フォトバイオリアクター (PBR) として AC を使用した実験室評価について報告します。 このような PBR は本質的に、蒸発による水の損失、外部汚染、捕食など、開いたレースウェイ池や閉じたフォトバイオリアクターで通常遭遇する運用上の問題の多くに対処します。 半分充填されたACを使用して、微細藻類種クロレラ・ブルガリス、ナンノクロロプシス・オクラタ、およびシクロテラ・クリプティカ（珪藻）の性能が検査され、無灰乾燥細胞重量および全体のバイオマス生産性は2.39 g/Lおよび298.55 mg/L/と決定されました。 N. oculata では 0.85 g/L および 141.36 mg/L/日、C. vulgaris では 0.85 g/L および 141.36 mg/L/日、C. cryptica では 0.67 g/L および 96.08 mg/L/日。 さらに、最大脂質生産性 25.54 mg/L/日 AFDCW と炭水化物生産性 53.69 mg/L/日 AFDCW が C. cryptica によって達成され、最大タンパク質生産性 247.42 mg/L/日 AFDCW が N. oculata によって達成されました。 この研究から得られたデータは、目的の最終製品、利用規模、生産コストに応じて、潜在的な微細藻類フォトバイオリアクターとして再利用および再利用されたACの適用可能性とライフサイクルプロファイルを決定するのに役立ちます。

過剰消費や過剰人口などの人間活動は、資源の枯渇、生態系や生息地の破壊、汚染を通じて生物物理環境の環境悪化を引き起こしています。 これには、天然魚の資源の減少や海洋プラスチック汚染のレベルの増加などが含まれますが、これらに限定されません。 これらの悪影響を軽減するには、環境資源、生産能力、廃棄物の相互接続性を認識した、水・食料・エネルギーの連携方法論に基づいた持続可能な開発が必要です。 これに伴い、リデュース、リユース、リサイクル、再利用（再考）という 4R の持続可能性の概念が、環境ライフサイクルアセスメント（LCA）アプローチ、特にプラスチック廃棄物管理戦略や公共政策を策定するアプローチに、より頻繁に組み込まれています1。 これらの持続可能性の 4R は新しい概念ではありませんが、2050 年の人口が 98 億人と推定され、最近 30 年間で 20 億人近く増加している世界において、今日ほど重要になったことはありません。 人口動向が今後も続くと仮定すると、世界の人口に栄養価の高いタンパク質やその他の生物製品を十分に供給するために、微細藻類の生産はますます必要になるでしょう2,3。

長年にわたり、温室効果ガス (GHG) のバランス 4 と水利用のバランス 5、6 に焦点を当てた多くの微細藻類の技術経済分析が発表されてきました。 藻類の大規模培養に対する多大な関心と努力は数十年にわたって研究されてきたが、この業界は依然として高い生産コストに悩まされており、培養および収穫方法論における革新的なアイデアの開発が必要となっている7。 微細藻類は、自然界で一般的に見られる単細胞生物であり、さまざまな環境条件下で繁栄します。 これらの環境の中には非常に敵対的なものもあり、その結果、環境ストレス要因に対抗するための生存メカニズムが内部で発達します。 これらの細胞ストレス反応の多くは、一般的な代謝産物やその他の機能性栄養素とともに、強力な紫外線曝露下で抗酸化物質やカロテノイドなどの商業的関心のある製品の生合成を引き起こします8。 微細藻類の商業生産は現在、レースウェイポンド（RWP）、チューブ、ポリエチレンビニール袋、屋内および屋外のフォトバイオリアクター（PBR）、発酵槽などのさまざまな培養設計を使用して行われています9、10、11、12。 多くの場合、屋外の無菌微細藻類の培養は、捕食者が排除され、栄養素と環境条件が制御されている屋内で増殖する接種材料から始まり、その後、大量生産のために屋外のタンクまたはレースウェイに移されます3。

詳細な「ゆりかごから墓場まで」の評価の結果により、発生する革新的な代替案に対する適切な研究開発開発およびプロジェクト改善戦略が明らかになります。 このような微細藻類バイオリファイナリーの代替案の 1 つがバブルファーミング (BF) です。この方法では、改良された農機具を使用して現場でプラスチック製のバブルラップのシートが製造され、その後の収穫のために各バブルが特定の水性藻類混合物で満たされた状態で地表に置かれることが想定されています 13 。 シートと個々の気泡の直径は、特定の地域の生育期と地形、予想される用途、および Diafuel (珪藻由来のバイオ燃料) などの望ましい最終用途に合わせてサイズ設定されます 14。 BF は本質的に、蒸発による水の損失、外部汚染、捕食など、開放型 RWP および閉鎖型 PBR システムで通常発生する運用上の問題の多くに対処します。 もう一つの微細藻類バイオリファイナリーの代替案は、微細藻類の廃水浄化のために NASA15 によって開発されたプラスチック製の OMEGA バイオリアクターで、沖合の水産養殖ケージの近く、陸上の家族向け/アグリビジネス規模の水産養殖場に近接した海岸近くのコミュニティに配備されています (非耕作地または休耕地の利用が可能になります)。およびBF/輪作）または沖合放流廃水処理。 OMEGA は、海洋環境に配備された大型の浮遊線状低密度ポリエチレン PBR に含まれる廃水を使用して微細藻類を培養するシステムであり、管状膜壁を横切る順浸透を利用して受動的に栄養素を濃縮し、微細藻類バイオマスを脱水して、後でバイオ燃料または肥料に変換します16。 。

本研究では、フォトバイオリアクターとして再利用および再利用されたプラスチックエアクッション（AC）梱包材を使用して、微細藻類の培養特性を評価しました。 AC は、二重材料のカスタム包装ソリューションで、通常はポリエチレンで製造され、空気を充填して出荷されます。 AC は、輸送中に多くの輸送用エンクロージャ内で貴重品を囲み、保護しているのが一般的です。 一般的な AC は、リサイクル可能な薄いプラスチック フィルムで構成されていますが、必ずしも生分解性である必要はありません。 近年、主に持続可能性と使いやすさの認識により、消費者が梱包にプチプチの使用からエアクッションへの移行が見られています。 また、エアコンは通常、使用時に空気で満たされるため、倉庫内で占めるスペースも少なくなり、保管コストが削減され、スペースの利用が改善され、その後の出荷での再利用が可能になります。 実際、世界の AC パッケージング市場規模は 2025 年までに 44 億ドルに達すると予測されており、年平均成長率は 7.0% です17。 この世界的な需要の増加は、過酷な輸送条件や表面から商品を保護する必要性が高まっていることが原因と考えられます。

エアコン生産の拡大を考慮すると、結果として生じるプラスチック廃棄物を削減および軽減するために、使用済みまたは余剰の材料をリサイクルまたは再利用することが重要です。 AC の考えられる再利用の 1 つは、微細藻類の培養です。 再利用および再利用された AC は、微細藻類バイオリファイナリー企業への資本投資を削減するのに役立つと同時に、培養中に隔離された汚染物質のない環境を提供します。 さらに、密閉型 AC は、蒸発による水の損失、外部汚染、捕食など、従来の開放型 RWP および閉鎖型 PBR 微細藻類生物生産で通常直面する多くの運用上の問題に本質的に対処します。 これに従って、我々の知る限りでは、3 つの微細藻類種 (淡水および海洋)、すなわち Chlorella vulgaris UTEX 395、Nannochromopsis oculata CCMP 525、および珪藻 Cyclotella cryptica CCMP 33218 による微細藻類の培養およびバイオマスおよび脂質生産の最初の実験室評価が行われました。は、市販の頻繁に廃棄される AC がそのまま PBR として機能するかどうか、またどの程度の生産性レベルで機能するかを判断するために実施されました。

この研究で使用された方法論は、最初は、AC の非特別に配合されたプラスチック材料全体で CO2 と O2 の積極的なガス交換が発生するかどうかを判断するための定性的アプローチに焦点を当てていました。 続いて、同じ非生物的条件[光、CO2 (通気/ガス交換)、pH、温度、体積]下でAC-PBRで培養した藻類の生理学的変化を、成長、生化学組成、および脂肪酸を分析することによって決定する定量的アプローチが続きます。プロフィール。 さらに、生体シリカの効果を解明するために、無灰乾燥重量と窒素元素分析を含む C. cryptica 試験が実施されました。 最後に、LC-MS (液体クロマトグラフィー質量分析) 分析を実行して、珪藻 C. cryptica による高価値カロテノイド フコキサンチンの合成を確認しました。 この評価からのデータは、潜在的なスタンドアロン微細藻類 PBR としての AC の概念的な適用性と有用性の決定、および LCA 技術経済分析に役立ち、最終的な経済性と実現可能性の決定は、その価値に応じて行われます。ターゲットの最終製品 (バイオマス、脂質、タンパク質、または炭水化物) が開発され、利用されるスケール。

Nannochromopsis oculata CCMP 525 (以下、N. oculata) および Cyclotella cryptica CCMP 332 (以下、C. cryptica) は、国立海洋藻類微生物叢センター (NCMA) (Bigelow 海洋科学研究所、米国メイン州) から入手しました。 N. oculata は多量栄養素改変 F/2 (Phyto Technology Laboratories、米国) 海洋培地で維持されました。 C. cryptica は多量栄養素改変 L1 (NCMA) 海洋培地で維持されました。 Chlorella vulgaris UTEX 395 (以下、C. vulgaris) は、テキサス大学 (米国オースティン) の藻類培養コレクションから購入し、ボールド基本培地 (BBM、Phyto Technology Laboratories、米国) で維持しました。 すべての培地の pH は、pH メーター (Orion 3 Star、Thermo Fisher、USA) を使用して 7.5 に設定しました。 接種材料の調製では、インキュベーターシェーカー (Excella E24、New Brunswick Scientific、エッペンドルフ、ドイツ）150 rpm、23 °C で 3 ～ 4 日間（対数期）。

ここで検討した 3 つの微細藻類種すべてに対して選択された AC-PBR は、通常輸送箱に入れられている市販の AC 包装材料でした。 研究中の一貫性を確保するために、十分な数の空気充填 AC ユニット (STOROpack 製 AIRplus) を入手しました。各ユニットの寸法は 90 mm × 180 mm × 0.0254 mm (3.543 × 7.087 × 0.001 インチ) で、透明な低密度ポリエチレン製です。 (LDPE)。 これらの AC の一部は、ここで説明する研究のために現場に保管され、一部は研究調査のためにインドのハリ シン グール大学の同僚に提供されました 19。 各供給源の AC-PBR は理論的には約 380 mL の液体を保持できます。 1/4、1/2、および 3/4 の容量で実行した予備実験では、テストした藻類種全体でほぼ同等の光学密度 (OD680 nm) の結果が明らかになりましたが、最も一貫した結果は半分の容量で得られました (補足データ)。 したがって、この研究では 1/2 充填 (約 190 mL) AC-PBR 構成が選択されました。

実際に成長が起こるかどうか、またどのレベルの生産性で成長するかを判断するための最初のステップは、AC-PBR 表面全体で CO2 と O2 のガス交換が起こるかどうかを確認することでした。 AC-PBR 表面全体での CO2 および O2 ガス交換の定性的結果は、「AC-PBR でのガス交換の決定」セクションで報告されています。

CO2: 2 台の AC-PBR に Airgas (米国) から供給された圧縮純粋 CO2 ガスを充填し、ヒートシールして水中に沈め、漏れがないことを確認しました。 1 つの AC-PBR (最初に 250 mL に充填) を 23 °C の研究室の卓上に置き、CO2 が正の勾配下で一晩、LDPE プラスチックを横切って大気中に拡散するかどうかを観察しました。 2 番目の AC-PBR (最初に CO2 で 300 mL まで充填) を、初期 pH 7.1 の水の蓋付き容器に浸漬しました。 容器内の総容積は５．５Ｌであり、ＡＣ－ＰＢＲからの気泡の流出や表面への付着は観察されなかった。

O2: 2 つの AC PBR に Bernzomatic (米国) から供給された圧縮純粋 O2 ガスを充填し、ヒートシールし、水中に浸漬して漏れがないことを確認しました。 1 つの AC-PBR を研究室の卓上に置き、O2 が正の勾配で一晩、LDPE プラスチックを通って大気中に拡散するかどうかを視覚的に観察しました。 2 番目の AC-PBR を総容積 3.0 L の蓋付き水容器に浸漬しましたが、AC-PBR から気泡が漏れたり、表面に付着したりすることは観察されませんでした。

ほとんどの微細藻類の研究では、炭素源としてろ過された圧縮 CO2 ガスを何らかの形で積極的かつ連続的に供給する PBR が記載されています。 AC CO2 ガス交換の結果は有望でしたが、AC-PBR 表面全体のガス交換だけで栽培期間全体を通して十分な CO2 が存在するかどうかという懸念が残りました。 C. vulgaris の予備試験では、微細藻類は視覚的に緑色のままであるものの、CO2 を追加補給しない場合、OD680 nm で測定した増殖は 10 日間の試験期間で 10.8% しか増加しなかったことが明らかになりました。 藻類株の増殖を促進するために、重炭酸ナトリウム (NaHCO3 = 48 g/L) を C. vulgaris と N. oculata の両方の AC-PBR に添加しました。 この手順は、最初に溶液飽和に達するまで（つまり、pH が安定するまで）濾過した圧縮 CO2 ガスをバブリングし、続いて媒体を飽和重炭酸ナトリウム溶液で pH 7 まで滴定することによってさらに修正されました。

適切な光強度は、光合成に必要なエネルギー源が AC-PBR プラスチック表面を通過するだけでなく、細胞間のシェーディング効果を軽減するために内部まで十分に浸透することを保証するための重要なパラメーターです20。 携帯型露出計（モデルＣＡ８１３、ＡＥＭＣ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ＡＣ ＰＢＲの表面における光強度を１メートル当たりのルーメン（ルクス）で測定した。 テスト実行は、C. vulgaris と N. oculata に対して 3 つの条件下で行われました: (1) 77 µmol/m2 秒で 1 つの照明 (Airand CT-X01A600-18 ナチュラル ホワイト LED ライト)、16:8 時間 (明:暗) で振動なし）光周期。 (2) 75 rpm、65 µmol/m2s で 24 時間 (連続) 照明を行うシェーカー テーブル上に 1 つの照明。 (3) 合計 180 µmol/m2s、16:8 時間 (明:暗) の光周期で 2 つの光。 非 CO2 強化培地を使用した最初の結果では、シェーカー テーブルと非シェーカーの 1 光構成の間に大きな OD の差はありませんでしたが、2 光の非シェーカーの結果は 1 光構成よりわずかに優れていました (データは示されていません)。 したがって、屋内ベースライン照明テスト構成として 2 列の LED ライトが選択されました。

細胞増殖が実際に AC-PBR 内で起こるかどうか、またどのレベルの生産性で起こるかを決定するという目標をサポートするために、選択した 3 つの微細藻類種のそれぞれをそれぞれの培地で 2 回実行しました。 試験したすべての種に対して、10% (v/v) の初期接種材料 (OD680 nm = 0.6 ～ 0.8) を使用しました。 シェーカー培養フラスコ内で適切な細胞ODが達成されたら、「微細藻類の培養」セクションで説明したように、各藻類懸濁液を採取し、新たに調製した培地に加えました。 藻類を添加する前に、溶液飽和に達するまで（つまり、pH が安定するまで滴下する）まで濾過した圧縮 CO2 ガスをバブリングすることによって培地を強化し、続いて中性 pH が達成されるまで飽和重炭酸ナトリウム (NaHCO3 = 48 g/L) を添加しました。 。 最終体積は、添加したＮａＨＣＯ３の量に基づいて多量栄養素溶液を用いて化学量論的に増加した。

AC-PBR テストを開始する前に、空気を充填した各 AC-PBR を UV-C 殺菌灯の下に 15 分間置き、内部容積を滅菌して汚染を防止しました。 AC の小さな開口部を通して、約 190 mL (作業容量) の藻類細胞懸濁液をピペッティングして内部に追加し、余分な空気を除去し、VacMaster Pro110 外部真空シーラー機を使用して AC-PBR (総容量 380 mL) を再密封しました。 システムに漏れがないかチェックされました。

各藻類株の AC-PBR を、光強度 180 μmol/m2s、光周期 16:8 時間 (明:暗) の 2 列の LED の下で、25 °C で振盪せずに保管しました。 培養は、各藻類が初期定常期に達するまで続けた(C. vulgaris-6日、N. oculata-8日、およびC.cryptica-7日)。 各菌株の AC-PBR 微細藻類培養試験セットアップの写真は、補足データにあります。

分光光度計 (DU 730、Beckman Coulter、Brea、CA、USA) を使用した 680 nm での光学密度 (OD680 nm) および乾燥細胞重量 (DCW、g/L) に関する藻類の成長を、各藻類種について 2 回繰り返して評価しました 21。 22. 24 時間ごとに各藻類の OD を測定して、成長曲線を導き出しました。 硝酸塩 (NO3-)、亜硝酸塩 (NO2-)、リン酸塩 (PO4-)、および pH は、テストストリップ (米国コロラド州ラブランドの Hach Company、およびニューヨーク州ブルックリンの Micro Essential Laboratory (HYDRION)) を使用して 24 時間ごとに測定されました。 、米国）。 培養の最後に、25℃、5000gで10分間遠心分離して藻類細胞を回収し、蒸留水（C. vulgaris）または0.9％NaCl溶液（N. oculataおよびC. cryptica）で2回洗浄して、メディアコンポーネントを削除します。 次いで、得られたバイオマスを50℃のオーブンに入れて一晩乾燥させた。 DCW は、ベンチトップ デジタル スケール (Mettler Toledo、米国) を使用して、次の式に従って重量測定で決定されました。

DCW 値は通常、灰分レベルが 10% 未満の微細藻類種に直接使用されます。 しかし、珪藻は通常、非炭素質シリカ外骨格の寄与によりかなりの鉱物灰分を含んでいます 23 が、緑藻類でも 10% 以上の灰分を示すことがあります 24。 その結果、灰分の割合がより高い種では、DCW 測定のみに基づく組成分析では生化学成分の濃度と生産性が過小評価される可能性があるため、個々の生化学成分の濃度と生産性を正確に測定できるように、無灰乾燥重量 (AFDCW; g/L) が決定されました。実際の金額25． AFDCW 測定では、乾燥バイオマスを事前に計量したアルミニウム計量皿に加え、その後再計量しました。 次に、パンをマッフルオーブンに置き、475 °C で 5 時間酸化 (灰化) しました。 冷却後、サンプルを再度秤量し、記録した。 AFDCW% は次の式に従って計算されました。

前述の高灰分の懸念のため、この研究では AFDCW が使用され、次の式に従って決定されました。

各実験設定について、総脂質含量、総炭水化物含量、および総タンパク質含量は、以前に公開されたプロトコールを使用して測定されました26。 簡単に説明すると、細胞破壊は液体窒素を用いて機械的に行われ、その後、脂質の分別と分離のための修正されたBligh and Dyer法を用いてクロロホルム/メタノール(2:1 v/v)を添加した。 総脂質をクロロホルム相から抽出し、真空乾燥し、重量測定した。 総炭水化物は、酸加水分解されたバイオマスを用いてフェノール硫酸法を使用して測定され、総タンパク質は、100% から脂質 %、炭水化物 %、および灰分 % を差し引いた残りとして計算されました 27,28。 バイオマス生産性、脂質含有量、および脂質生産性は、以下の式を使用して計算されました。

サンプル調製は標準プロトコル 29 を使用して実行され、FAME 測定は以前に公開されたプロトコル 30 に従いました。 より具体的には、藻類細胞から抽出された総脂質 (5 ～ 10 mg) をクロロホルムに溶解し、透明なガラスバイアルに移し、次に C13 を含む 0.6 M メタノール性 HCl を内部標準としてガラスバイアルに加え、密封して加熱しました。 85℃で1時間反応させてエステル交換反応を起こさせます。 次に、バイアルを室温まで冷却し、密封し、GC-MS 分析 (Agilent Technologies 7200 GC-MS) によってヘキサンを使用して FAME 抽出が行われるまで、-20 °C の冷凍庫に保管しました。 FAME 組成は、NIST (国立標準技術研究所) の質量スペクトル標準参照データベースを使用して特定されました。 FAME の同定と定量化は、保持時間を分析し、ライブラリ検索レポート (NISTIL.S データベース) を使用することによって行われました。

C. cryptica からのフコキサンチン抽出では、50 mg の凍結乾燥バイオマスを液体窒素を使用して粉砕し、続いてエタノール (100%) を使用してカロテノイドを抽出しました。 細胞懸濁液をガラスバイアルに移し、暗所で 4 °C で一晩インキュベートしました。 細胞ペレットが無色になるまでこのプロセスを繰り返しました。 次に、エタノール抽出物を真空乾燥し、Agilent technology 6460 トリプル四重極 (QQQ) (Agilent 1100 シリーズ、K1260 Infinity (2) スタック) を使用した LC-MS 用に 1 mL のメタノールに再懸濁しました。 フコキサンチンの分離と定量は、以前に公開されたプロトコル 30 に基づいて実行されました。 移動相はメタノールと水で構成され、流速 0.400 mL/min、35 °C で C18 逆相カラム Eclipse Plus (Agilent、カリフォルニア州サンタクララ、米国) での勾配溶出と 445 nm で記録されたクロマトグラムでした。 フコキサンチン標準 (カタログ番号 F6932-10 mg、バッチ番号 MKCP1541、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して、溶出した前駆体イオンフラグメントの存在と位置を確認し、ある濃度にわたる検量線を作成しました。範囲は 1 ～ 10 µg/mL (補足データ)。

LC-MS の結果は分光測定結果とも比較されました。 分光光度分析では、カロテノイドを 1 mL のヘキサンに溶解し、663 nm と 445 nm で吸光度を読みました。 フコキサンチン濃度は、フコキサンチン検量線 (0.2 ～ 10 μg/mL) を使用して計算されました (補足データ)。 445 nm でのフコキサンチンの吸光度は、663 での吸光度 (クロロフィル干渉) を差し引くことによって補正されました。 この補正が必要なのは、検量線がフコキサンチンのみに関するものであり、クロロフィル (663 の A および C) とフコキサンチン (445) の吸収の間に重複が存在する可能性があるためです。

すべての実験は 2 回実行され、平均値 ± 標準偏差 (SD) が報告されました。 データは、Graph Pad Prism v 9.4 を使用してプロットされました。

AC-PBR 内のガス交換を決定するために、LDPE プラスチック全体にわたる CO2 および O2 の拡散速度を定性的に推定しました。 CO2 (300 mL) で満たされた AC-PBR は、約 24 時間後に平らになり、封入された CO2 が外気へ勾配拡散していることが確認されました。 さらに、初期 pH 7.1 の水に浸漬した AC-PBR も、約 24 時間後には平らになり、水の pH は 5.7 に低下しました。これにより、封入された CO2 の水中への勾配拡散とその後の炭酸 (H2CO3) の形成が再度確認されました。 ）。 空中移送に方向性があるかどうかを確認するために、受け取ったままの空気を充填した別個の AC-PBR を密閉可能な広口ガラス瓶に入れ、瓶に CO2 を満たして密閉しました。 翌朝、同様に約 24 時間後、AC-PBR の高さは瓶の口より直径が約 4 倍に膨れ上がっていることが判明し、外側 CO2 の勾配の下で瓶の外に拡散したことが確認されました。内部の空気が満たされた領域にLDPE AC壁を挿入します。

同様に、純粋な O2 を充填した AC-PBR は、約 24 時間後に元の体積よりも体積が小さくなっていることがわかりましたが、以前の CO2 テストほど平坦ではなく、密閉された O2 が環境下で外気へ拡散することが確認されました。勾配はありますが、その速度は CO2 よりもはるかに低いです。 また、水没した AC-PBR は、総水量が約 2.95 L に減少し、体積がわずかに小さくなったように見えます。また、封入された O2 が勾配の下で、しかし CO2 よりもはるかに低い速度で外部の水へ拡散することが確認されました。 注目すべき点の 1 つは、AC-PBR の表面に多数の小さな気泡が付着していることです。これらの気泡は、水中 O2 テストでは存在していましたが、水中 CO2 テストでは存在していませんでした。

結論として、CO2 と O2 の両方が正の勾配の下で AC-PBR 表面全体に拡散し、CO2 がはるかに高い速度で拡散することが観察されました。 この観察は、Guisheng 31 によって報告されている文献によって裏付けられています。Guisheng は、30 ℃でのLDPE の CO2 と O2 の透過性の相対値がそれぞれ 10.7 と 3.1 であると引用しています 32。 上記の発見は、広口のガラス瓶に池の水を満たし、瓶の縁に張った 1 枚の AIRplus AC プラスチック フィルムで密閉し、2 本の輪ゴムで固定したカーンの結果 19 を補完するものでした。 50日後の結果では、藻類は水分量の減少が観察されずに緑色のままであることが明らかになり、存在する藻類が光合成と呼吸に必要なガス（CO2とO2）の十分な交換を経験していることが確認されました。 全体として、これらの肯定的な結果を総合すると、AC での藻類培養研究を継続することが正当化され、その間、O2 毒性の蓄積と水分損失による成長期間および/またはパフォーマンスへの悪影響が監視されます。

AC-PBR 表面を介した効率的なガス移動が観察されましたが、培養期間を通して CO2 が存在することを保証するために、各藻類株のそれぞれの培地には CO2 のバブリングに加えて 48 g/L の NaHCO3 が補充されました。 これにより、CO2 を強化していない新鮮な培地および海洋培地と比較して、C. vulgaris ではほぼ 4 倍、N. oculate ではほぼ 8 倍、OD680 nm が大幅に増加する CO2-重炭酸緩衝システム 33 が確立されました (データは示されていません)。 これらの観察に基づいて、CO2 中でバブリングし、その後中性 pH になるまで重炭酸ナトリウムを添加する手順が、珪藻 C. cryptica を含む、テストされたすべての種のベースライン構成の一部になりました。

再利用および再利用されたプラスチック AC-PBR の微細藻類培養への適用性を調べるために、C. vulgaris、N. oculata、および C. cryptica の 3 つの新鮮な海藻株を選択しました。 C. vulgaris は、栄養補助食品やタンパク質が豊富な食品添加物としてよく使用される淡水モデルの緑色微細藻類であり、高いバイオマスと細胞内脂質含量を蓄積することも報告されています 33。 N. oculata は光独立栄養性、単細胞、浮遊性の海洋緑藻であり、魚の幼生やワムシのエネルギー豊富な食料源として水産養殖でよく使用されます 34,35。 さらに、適切な培養条件下では高レベルの多価不飽和脂肪酸 (PUFA) やアスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチンなどのカロテノイドを蓄積する能力があるため、産業および栄養補助食品への応用が期待できる藻類と考えられています。 C. cryptica は、光/従属栄養性の単細胞、浮遊性、中心性の海洋珪藻 (褐藻) であり、水産養殖の飼料によく使用されます 36。 高レベルの PUFA とカロテノイドのフコキサンチンを蓄積する能力があるため、産業および栄養補助食品への応用に有望な藻類と考えられています 37,38。 さらに、珪藻はほぼ純粋な非晶質の水和シリカ殻 (小殻) を特徴とするため、高品質用途向けの生体シリカの潜在的な供給源としても機能します 39,40。 最後に、C. cryptica は、β-キチン ナノフィブリル (繊維) を生成することも知られています 3,41。これは、プラスチックよりも優れた生分解性を持つ生体膜やバイオプラスチックの製造に使用される可能性があります 42,43,44。 高レベルのタンパク質および炭水化物ベースのポリマーを含む天然資源からのバイオベースプラスチックの生産は、従来の石油ベースのプラスチックを代替または補完する生分解性の代替品となります45,46。

注目すべきことに、3 つの藻類株はすべて AC-PBR に適応して生育することができ、N. オキュラータが 4.01 ± 0.20 の OD680 nm に達し、最も高い生育レベルを示し、次に C. vulgaris および C. cryptica が続きました (図 1A)。 。 藻類株は 1 日の遅滞期 (0 ～ 1 日) を示し、その後 2 ～ 5 日目に増殖しました。増殖曲線によると、C. vulgaris は 6 日目に初期の定常期 (収穫時期) に達しましたが、N. oculata と C. cryptica はそれぞれ 8 日目と 7 日目まで増殖を続けました (図 1A)。 残留硝酸塩とリン酸塩のおおよその測定により、C. vulgaris の培養物では 6 日目にこれら 2 つの主要栄養素が枯渇していることが明らかになりましたが、N. oculata と C. cryptica の培養物では 8 日目に 250 mg/L と 10 mg/L の硝酸塩とリン酸塩が残留していました。それぞれ、7日目と7日目であり、成長期間がより長いことを説明しています。 特定の海洋藻類と珪藻には、総バイオマスの 22 ～ 47% のミネラルとシリカが含まれていることが知られているため、バイオマスの過大評価を避けるために、すべての藻類の DCW を調整しました。 文献のレビューにより、C. vulgaris の灰分レベルは約 5 ～ 6% と低いことが明らかになりました 47,48。そのため、一般的な研究慣行に従って、ここでは灰分％に関する調整は行われませんでした（つまり、AFDCW (g) = DCW (g) ））。 N. oculata および Nannochromopsis sp. に関する文献のレビュー。 それぞれ 24.5% と 27.3% で一貫した灰レベルが明らかになりました 49,50。 したがって、この分析では、平均値 25.9% の灰分が使用されました。 珪藻に関する文献を調べると、Hildebrand26 が灰分含有量が 49 ～ 59% の 8 つの異なる珪藻種を比較し、珪藻の灰分含有量はさまざまな非ケイ化藻類の平均 2 倍、調査した 2 つのクラミドモナス種の灰分含有量の 4 倍であることが明らかになりました。 乾燥重量の有機含有量の珪藻種の計算では、より大きな値とシリカ含有量の変動が認められるため、文献平均灰分含有量 45.4% を使用して、C. cryptica について AFDCW% の直接重複測定を行いました。

(A) 増殖曲線 (OD680 nm)。 （B）AC-PBRで培養したC. vulgaris、N. oculata、およびC. crypticaの無灰乾燥細胞重量（AFDCW; g/L）およびバイオマス生産性（mg/L d）。

全体として、最も高い AFDCW およびバイオマス生産性の 2.39 g/L および 298.55 mg/L/日は N. oculata によって達成され、次に C. vulgaris の 0.85 g/L および 141.36 mg/L/日、そして C. cryptica の 2.39 g/L および 298.55 mg/L/日が続きました。 0.67 g/L および 96.08 mg/L/日 (図 1B)。 従来の RWP および PBR について公表されているベースラインの藻類バイオマス生産性の値は、通常、それぞれ 0.5 ～ 1 g/L および 2 ～ 6 g/L の範囲内に収まります51。 したがって、観察された藻類株の AC-PBR バイオマス生産性は、屋内 PBR および RWP について報告されている生産性と同等であり (表 1)52、53、54、これにより、AC を PBR として費用効率よく使用できる可能性が信頼できるものとなっています。 「設定したらあとは忘れる」栄養豊富な藻類培養システムとして。

種に応じて、微細藻類バイオマスは主に炭水化物 (4 ～ 64%)、脂質 (4 ～ 45%)、およびタンパク質 (6 ～ 71%) で構成されています55。 前述したように、生化学組成に灰分が含まれると高分子の過大評価につながる可能性があるため、総タンパク質、総炭水化物、総脂質とそれぞれの生産性は AFDCW に基づいて計算されました (図 2A、B)。 最大脂質含量（26.58 ± 0.30% AFDCW）は C. cryptica で達成され、続いて C. vulgaris で 17.66 ± 0.30% AFDCW、N. oculata で 6.82 ± 0.21% AFDCW でした（図 2A）。 同様に、最大の脂質生産性（25.54 ± 0.33 mg/L/日 AFDCW）は C. cryptica によって達成され、次に C. vulgaris の 24.96 ± 0.31 mg/L/日、そして N. oculata の 20.35 ± 0.51 mg/日が続きました。 L/日 (図 2B)。 C. vulgarisはN. oculataよりもバイオマス濃度が低く、C. crypticaよりも高いバイオマス濃度を示しましたが、脂質生産性はどちらとも有意差はありませんでした（図2B）。 前のセクションで述べたように、C. vulgaris 培養物では硝酸塩は完全に枯渇しましたが、N. oculata 改変 F/2 培地および C. cryptica L1 培地には培養終了時にいくらか (50 ～ 250 mg/L) の硝酸塩が残っていました。サイクル。 実際、以前の研究では、窒素飢餓がいくつかの藻類による細胞内脂質の生合成を引き起こすことが報告されています。 したがって、藻類種の脂質含有量の増加は窒素の枯渇に起因する可能性があります 56,57。

(A) 生化学組成 (%); (B) AC-PBR で培養された C. vulgaris、N. oculata、および C. cryptica の生産性 (mg/L d)。

藻類は初期の栄養ストレス下で最初に炭水化物を合成し、その後ストレスが長期化すると脂質生合成に切り替わることが報告されています58。 C. cryptica 珪藻バイオマスには大量のシリカが存在するため、標準的なフェノール硫酸法とブラッドフォードアッセイを使用して、それぞれ総炭水化物量と総タンパク質量を測定することができなかったため、元素分析 (CHNS) を選択しました。 珪藻中のタンパク質含量は、窒素からタンパク質への変換係数 (NtP) によって推定されました。 よく使用される NtP 換算値は、プロテイン 59 の共通元素組成 C40H62N10O12 を使用したシリアルに基づく 6.25 で、式の窒素含有量は 16%、その逆数 (1/0.16) は 6.2560.61 に等しくなります。 しかし、その後の研究では、この値は高すぎる可能性があり、藻類バイオマスには平均係数 4.78 を使用し、珪藻 Phaeodactylum tricornutum では 4.68 を測定する必要があることが示されました 62。 CHNS 分析データは、C. cryptica バイオマス中の % N が 2.05 ± 0.07 であり、DCW の総タンパク質含量の 9.6% に相当することを示しました。 次いで、ＡＦＤＣＷ炭水化物含有量を、総ＡＦＤＣＷ脂質および総タンパク質ＡＦＤＣＷ含有量を差し引くことによって計算した。 AFDCW ベースの炭水化物生産性が最も高いのは、C. cryptica の 53.69 ± 0.19 mg/L/日であり、続いて N. oculata の 30.78 ± 1.81 mg/L/日、C. vulgaris の 22.61 ± 2.72 mg/L/日でした。 (図2B)。 AFDCW に基づくタンパク質生産性が最も高いのは、N. oculata で 247.42 ± 14.16 mg/L/日、次いで C. vulgaris の 93.80 ± 1.74 mg/L/日、C. cryptica の 16.85 ± 0.03 mg/L/日 (図２Ｂ）。 すべてを総合すると、タンパク質、脂質、炭水化物の生化学的生産性の値は、屋内 PBR で培養されたこれらの菌株について文献で報告されている値と同等であり、プラスチックの再利用に貢献する低コストの持続可能な培養システムとしての AC-PBR の可能性を強化します。 （表1）。

脂肪酸プロファイルの変化を調べるために、AC-PBR で培養した C. vulgaris、N. oculata、および C. cryptica の FAME プロファイルの決定を実行しました。 C. vulgaris の FAME プロファイルは、主にパルミチン酸 (16:0)、ヘキサデカトリエン酸 (16:3)、オレイン酸 (18:1)、リノール酸 (C18:2)、およびステアリン酸 (C18:0) で構成されることが判明しました。 ）、これは以前に発表された研究6,58と一致しています（図3）。 飽和脂肪酸 (SFA、二重結合なし)、一価不飽和脂肪酸 (MUFA、二重結合 1 つ)、および多価不飽和脂肪酸 (PUFA、二重結合 2 つ以上) が、脂肪酸全体の 34.25%、43.62%、および 22.14% を占めました。内容はそれぞれ。 前述したように、C. vulgaris 培養物では硝酸塩が枯渇し、明らかに C18:1 の蓄積が観察されています。C18:1 は、栄養欠乏時に生成される活性酸素種を消失させるのに重要な役割を果たしています 26。 さらに、MUFA および PUFA 含量が高いほど、膜脂質生合成の前駆体であり、膜調節を助けるため、栄養素の枯渇下では好まれます。 N. oculata FAME プロファイルは主に C16:0、C16:3、C18:1、および C18:2 で構成され、少量のエイコサペンタエン酸 (EPA) C20:5 および C24:1 が含まれていました (図 3)。 SFA、MUFA、PUFA はそれぞれ総脂肪酸の 34.96%、39.57%、25.47% を占めました。 これらの結果は、以前に報告された Nannochromopsis sp.30、34 の FAME プロファイルと一致しています。 N. oculata の膜脂質には、EPA、C20:4、C24:1 などの長鎖 (LC) PUFA が含まれており、藻類バイオマス中のこれらの脂肪酸の存在に寄与しています。 最後に、C. cryptica FAME プロファイルは主に C14:0、C16:0、C16:1、C16:2、C16:3、C20:5、およびドコサヘキサエン酸 (DHA) C22:6 で構成されていました (図 3)。 SFA、MUFA、PUFA はそれぞれ総脂肪酸の 40.63%、35.94%、23.43% を占めました。 これらの所見は、DHA (0.74%)、比較的高レベルの EPA (7.58%)、微量の C18 脂肪酸の存在など、文献に記載されている珪藻関連の内容と一致しています 63,64。

AC-PBR で培養した C. vulgaris、N. oculata、および C. cryptica の相対 FAME プロファイル (%)。

最終用途では、低温流動性と酸化安定性を考慮すると、MUFA がより優れたバイオディーゼルを生成します。一方、PUFA は、DHA や EPA と同様、製薬業界や化粧品業界で使用される最終製品で人間の健康に有益であることが示されています。カロテノイドのフコキサンチンの栄養補助食品に含まれています。 3 つの菌株はすべて、タンパク質が豊富な C. vulgaris 44,65 および N. oculata または C. cryptica の β-キチン ナノフィブリルを介したバイオ燃料、栄養補助食品、およびバイオプラスチックの生産において同等の脂質生産性を示しました。 さらに、使用される副産物抽出プロセスに応じて、タンパク質が豊富に含まれる残りの藻類バイオマスは、動物や水産養殖の飼料を増やすための原料として機能するだけでなく、人口の増加や変化によって引き起こされる人間の栄養ニーズにも貢献する可能性があります。気候変動と農業に適した耕地の利用可能性の減少42,66。

フコキサンチンは、大型藻類 (海藻) と微細藻類の両方に豊富に存在する主要な海洋カロテノイドで、自然界のカロテノイドの推定総生産量の約 10% に寄与しています 67,68。 微細藻類、特に C. cryptica のような珪藻では、オレンジ色のフコキサンチン (C42H58O6) は主要な光合成細胞色素の 1 つであり、細胞が光を収集してエネルギーを伝達するために使用される非プロビタミン A カロテノイド 69,70 であり、他の 2 つの主要な色素も同様です。光合成の集光色素はクロロフィル a (chl a) およびクロロフィル c (chl c) です8。 近年、フコキサンチンは、抗炎症作用、抗腫瘍作用、抗肥満作用、抗糖尿病作用、抗マラリア治療作用の観点から栄養補助食品として研究されています71。 現在、フコキサンチンは主に成長が遅くフコキサンチン含有量の少ない海藻から生産されています。 より速く成長する微細藻類は、その容易な培養と拡張性の特性により、フコキサンチン生産のための重要な代替オプションです72。 AC-PBR で培養した C. cryptica の LC-MS 分析では、フコキサンチン濃度が 0.868 mg/g DCW (0.474 mg/g AFDCW) であり、フコキサンチン生産性が 0.570 mg/L d (0.311 mg/L d AFDCW) であることが示されました (図4）。 LC-MS の結果は、分光光度法によるフコキサンチン濃度の結果 (0.822 mg/g DCW) と同等であり、珪藻サンプル中のフコキサンチンを検出するためのより簡単かつ迅速な方法であることが証明されました。 計算された DCW フコキサンチン生産性値 0.570 mg/L d は、三角フラスコで培養された C. cryptica (CCMP 333; ~ 0.12 mg/L d) を含む 13 種類の珪藻の上限値 ~ 0.23 mg/L d の 2 倍以上でした。改良 SK 培地で、30 µmol/m2s の低い光強度と 14 日間の長い培養期間で培養しました。

AC-PBRで培養したC.クリプティカのフコキサンチン濃度(mg/g DCW)および生産性(mg/L d)。

単一のバイオ製品を目的とした微細藻類の培養は、これまでのところ限定的な経済的成功しか得られていない。 この認識により、企業全体の焦点が複数製品のバイオリファイナリー構造へと移行し、目標とする製品、共製品、および設計におけるシステムの改善が、収益プロセスを改善することで操業全体の成功に積極的に貢献します。経済。 この研究では、C. vulgaris、N. oculata、および珪藻 C. cryptica を増殖させるための低コストおよび低労力の PBR としての AC の実験室評価を実行しました。 再利用および再利用されたエアコン (1) プラスチックの製造と廃棄物を削減および軽減し、持続可能性への取り組みに貢献します。 (2) バイオリファイナリーの設備投資を削減する。 (3) 藻類の成長および生物産物の合成中に、隔離された汚染物質のない環境を提供する。 生成されたデータは、藻類バイオマス、脂質、およびフコキサンチンの生産性に関する文献に記載されている従来の PBR 値と良好に比較され、したがって、検討中の異なる設計および構成の他のポリエチレンベースのビニール袋 PBR の基準点となります。 最終的に、AC の適用性と有用性は、開発された製品の最適化の程度、利用規模、全体的な経済性に依存します。 AC-PBR には、高価値の製品/分子の製造や微細藻類バイオフィルム培養などの代替培養経路の研究など、いくつかの直接使用用途が想定されています。

現在の研究で使用および/または分析されたデータセットは、Box.com オンライン データ リポジトリ、https://usf.app.box.com/s/3nctk2w36hwn7cjwqk7v4a4lpnxduuv6 で入手できます。

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この研究は、USF の海洋科学大学 (CMS)、USF のパテル グローバル サステナビリティ大学のフィリピディス博士のバイオ燃料およびバイオ製品研究所によって部分的に支援されました。 LC-MS/MS Q-TOF、GC-MS/MS、および凍結乾燥装置へのアクセスを介した USF 化学精製、分析、およびスクリーニング コア施設。 USF の CMS 環境化学研究所では、CF-EA-IRMS による窒素および炭素同位体およびバルク組成測定を行っています。 ビゲロー国立海洋藻類微生物叢センターによる無灰乾燥重量試験。 著者らは、バブル ファーミングを紹介してくれたリチャード ゴードン博士に感謝の意を表します。

南フロリダ大学海洋科学部、セントピーターズバーグ、フロリダ州、米国

クリフォード・R・メルツ

南フロリダ大学、細胞、微生物学、分子生物学部、米国フロリダ州タンパ

Neha Arora

パテル・グローバル・サステナビリティ大学、南フロリダ大学、タンパ、フロリダ州、米国

マイケル・ウェルチ、エンリン・ロー、ジョージ・P・フィリピディス

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CRM: 概念化、監督、プロジェクト管理、リソース、資金調達、調査、藻類成長モニタリング試験、原稿原案の作成、レビューおよび編集。 NA: 方法論、藻類の栽培、フコキサンチンの測定、原稿のレビューと編集、MW: 研究室での調査、藻類の栽培成長モニタリング試験と収穫。 EL: 生化学組成および FAME 測定。 GPP: 原稿の最終レビューと編集。

クリフォード・R・メルツ氏への往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

メルツ、CR、アローラ、N.、ウェルチ、M. 他。 市販のエアクッション包装材をフォトバイオリアクターとして使用した微細藻類の培養特性。 Sci Rep 13、3792 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30080-6

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受信日: 2022 年 8 月 17 日

受理日: 2023 年 2 月 15 日

公開日: 2023 年 3 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30080-6

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